當前位置:首頁 > 藥品天地 > 專業藥學 > 中藥大全 > 中藥指紋圖譜 > 高速逆流色譜法分離純化丹參并嘗試制訂中藥指紋譜

高速逆流色譜法分離純化丹參并嘗試制訂中藥指紋譜

來源:生物工程學報 作者: 2010-10-19
336*280 ads

摘要: 來源:生物工程學報 摘要:用國產高速逆流色譜(HSCCC)分離純化中草藥——丹參,選用正己烷-乙醇-水體系,固定相保留率達到78。采用分步洗脫,3個產地丹參各分離得到12個洗脫組分,經高效液相色譜儀和紫外光譜儀檢測證明3張HSCCC洗脫圖譜中對應洗脫峰為同一組分。高速逆流色譜(High-SpeedCounter-CurrentChromatography......


  來源:生物工程學報

    摘要:用國產高速逆流色譜(HSCCC)分離純化中草藥——丹參,選用正己烷-乙醇-水體系,固定相保留率達到78.8%。采用分步洗脫,3個產地丹參各分離得到12個洗脫組分,經高效液相色譜儀和紫外光譜儀檢測證明3張HSCCC洗脫圖譜中對應洗脫峰為同一組分。HSCCC洗脫圖譜不包含非共有峰,并且對應洗脫峰保留時間的相對標準偏差RSD<3%,符合國家標準關于制訂指紋圖譜方法學考察資料的技術參數。因此,HSCCC作為制訂指紋圖譜的方法之一具有可行性。

  高速逆流色譜(High-SpeedCounter-CurrentChromatography,HSCCC)是一種基于液—液多級逆流萃取建立的色譜體系,沒有固相載體,避免了待分離樣品與固相載體表面產生化學反應而變化和不可逆吸附[1];高速逆流色譜可以直接純化粗制樣品;尤其適于分離極性較大的組分[2];HSCCC的儀器及試劑成本明顯低于高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC),適用于制備高純度、高附加值的化合物。

  中藥材的主要活性成分是次生代謝物,對后天的生長環境依賴性很強,使得活性成分的種類和含量因地域、氣候和采收期有較大的差異,迫切要求建立中藥材的質量標準。中藥指紋圖譜是近年來被廣泛采用的質控方法,它是運用現代分析技術對中藥化學信息以圖形(圖象)的方式進行表征并加以描述[3]。每種分析方法只能表達中藥材的部分化學信息,必要時可由多種方法來制訂一組圖譜共同構成指紋圖譜。最常用的分析手段是色譜(薄層層析TLC、高效液相色譜HPLC和氣相色譜GC)和光(波)譜(紫外光譜UV、紅外光譜IR、質譜MS和核磁共振波譜NMR)。光譜和波譜指紋圖譜由于選擇性的限制,不能表達中藥這樣的混合體系中各種不同化學成分濃度分布的整體狀況,因此色譜指紋圖譜成為首選方法[4]。TLC操作簡便、成本低廉,但精密度較差;HPLC精密度高,重現性好,適用范圍較廣,但需要有嚴格的樣品預處理,很難分析易造成固定相吸附的樣品和高粘度的樣品;GC適用范圍非常有限。因此本文提出使用高速逆流色譜(HSCCC)作為制訂中藥指紋圖譜的方法之一。

  選用丹參作為模式物。丹參具有活血通經、去淤止痛、清心除煩等功效,近來也被用于糖尿病的輔助治療[5]。在以往的研究報道中,利用逆流色譜分離純化丹參最多得到8種組分[6,7,8]。本文一方面摸索分離丹參適宜的溶劑體系和儀器參數,分離得到盡可能多的組分,使洗脫圖譜中包含充分的化學信息,為制訂指紋圖譜打下基礎;另一方面探索使用高速逆流色譜制訂中藥指紋圖譜的可行性。

  1、材料與方法

  1.1儀器

  1.1.1TBE-300半制備型高速逆流色譜儀(深圳同田生化技術有限公司,中國)。聚四氟乙烯管纏繞在3個水平軸上形成螺旋管(管直徑2.6mm,分離體積300mL),進樣圈20mL。高速逆流色譜配備了柱塞式泵(S系列,北京圣益通技術開發有限責任公司,中國),紫外檢測儀(8823A,北京新技術應用研究所,中國),記錄儀(3057型,四川記錄儀器廠,中國)。

  1.1.2高效液相色譜(10Avp系列,島津,日本):雙泵系統(LC-10ATvp),紫外檢測儀(SPD-10Avp),柱溫箱(CTO-10ASvp),系統控制器(SCL-10Avp),控制軟件(Class-vp),20μL進樣圈;色譜柱:反向C18柱(150mm×4.6mmI.D.,5μm)。

  1.2試劑

  1.2.1高速逆流色譜試劑采用分析純(天津化學試劑一廠)。水是通過反滲透Mili-Q(18MΩ,Milipore,USA)制備。

  1.2.2高效液相色譜試劑采用一級色譜純(FisherScientificCo.Ltd.,UK)。將反滲透處理過的水(18MΩ,Milipore,USA)通過0.45μm濾膜減壓過濾后使用。標準對照品用高速逆流色譜的流動相配制成1mg/mL,經0.45μm濾膜過濾使用。

  1.2.3丹參:來自3個產地:河北、山東、江蘇。

  1.2.4標準對照品:國家藥品監督管理局,中國藥品與生物制品檢定所提供。

  1.3丹參粗提物的制備

  將丹參根或根莖粉碎成粗粉或細粉;20g丹參粉溶于50mL溶劑(正己烷:乙醇=1:1,V/V),充分攪拌45min,沉降后取上清;沉淀再溶于25mL溶劑,充分攪拌45min,沉降后取上清;離心10000g×10min,棄沉淀,留上清,定容;按1:2(V/V)的比例加水,在分液漏斗中搖勻,靜置過夜,分相;取上相(有機相),定容;用2倍于有機相體積的30%乙醇洗至下相(水相)接近無色;取上相(有機相),在真空干燥器內充分干燥成干粉;分離前稱量100mg用溶劑體系A的下相溶解,并通過超聲振蕩提高溶解度;離心10000g×2min,取上清上樣[8];粗提品收率約為2%。

  1.4高速逆流色譜流動相的配制

  溶劑體系A:正己烷:乙醇:水=10:5.5:4.5(V/V),溶劑體系B:正己烷:乙醇:水=10:7:3(V/V)。

  1.5高速逆流色譜分離步驟

  分離純化過程中采用溶劑體系A和B進行分步洗脫:將溶劑體系A的上相以9.99mL/min的速度泵入螺旋管使之充滿,作為固定相;高速逆流色譜儀以900r/min的轉速運轉,同時以2.0mL/min的速度泵入溶劑體系A的下相,作為流動相;當流動相的前沿出現(即流出高速逆流色譜的出口端),說明兩相平衡建立;用溶劑體系A的下相溶解粗提物,超聲波助溶,離心后取上清,從進樣閥上樣6mL,100mg;洗脫過程中紫外檢測儀在280nm連續監測;根據記錄儀所顯示的洗脫峰收集洗脫組分;洗脫470min后更換流動相為溶劑體系B的下相進行洗脫。

  1.6高效液相色譜分析

  標準品、洗脫組分均采用高效液相色譜分析。二元梯度洗脫:溶劑A(0.1%三氟乙酸,TFA),溶劑B(0.1%TFA+乙腈)。洗脫方式如下:0~5min,0%B;5~25min,0~70%B;25~40min,70%B;40~41min,70~0%B。流速1mL/min,檢測波長280nm。每檢測1個樣品,以乙腈清洗色譜柱。

  1.7紫外—可見分光光度計分析

  標準品和洗脫組分采用紫外—可見分光光度計進行掃描,掃描波長:900-200nm。

  2、結果與討論

  2.1高速逆流色譜分離純化丹參粗提品

  丹參的有效成分主要分為兩類:脂溶性化合物和水溶性化合物,大多數的活性成分集中在脂溶性化合物中,因此本文僅限于研究丹參中脂溶性化合物的分離和純化[9]。用HSCCC分離純化河北產丹參,研究溶劑體系和儀器參數。提高HSCCC轉速、降低流動相流速有助于提高固定相保留,使系統的分辨率得到保證,同時兼顧運行時間,確定HSCCC轉速為900r/min,流動相流速為2mL/min,固定相保留率達到78.8%。(1)采用一步法洗脫,即自始至終用溶劑系統A的下相,整個洗脫過程耗時18h,各洗脫峰分離度較好,但最后2個峰的峰寬增大,靈敏度下降;(2)采用分步洗脫:在210min前用溶劑系統A的下相作為流動相,之后換為系統B的下相,運行時間縮短至9h,更換流動相后的2個洗脫峰分離度明顯下降Rs<0.8;(3)為改善分離度調整分步洗脫的條件:在470min更換流動相為體系B的下相,運行時間為12h,分離度Rs>1.25。在達到較好分離度的基礎上,盡量縮短運行時間,因此采用方法3,即0~470min以溶劑體系A的下相為流動相,470min后以體系B的下相為流動相。采用以上條件對另2個產地的丹參粗提物進行了分離純化。圖1顯示了3個產地的丹參樣品經高速逆流色譜分離純化的洗脫曲線,各得到洗脫峰12個,利用國產HSCCC可以有效地分離純化丹參。

  2.23張洗脫圖譜中洗脫峰的對應性

  3個產地的丹參經HSCCC純化,各得到12個洗脫峰,峰的數目一致,但必須確定3張洗脫圖譜中對應的洗脫峰是否為同一組分。對各洗脫峰進行分析:依方法1.6測定各洗脫峰在反相高效液相色譜(HPLC)上的保留時間;依方法1.7在紫外-可見分光光度計900-200nm范圍對各洗脫峰進行全波長掃描,得到吸收光譜。由表1和2可見,3條HSCCC洗脫曲線中的洗脫峰1和2的保留時間及吸收波長相似,但沒有足夠的證據認為洗脫峰1和2為同一物質。從HPLC保留時間和紫外吸收光譜還可判定,3個產地丹參洗脫曲線中的第n(n為1-12)個洗脫峰為同一組分。也就是說,3個產地丹參的HSCCC洗脫圖譜,不但洗脫峰個數一致,而且對應洗脫峰為同一組分。

  2.3高速逆流色譜作為制訂指紋圖譜的方法之一

  從3個產地丹參的HSCCC洗脫圖譜可以計算出,對應洗脫峰雖為同一組分但峰面積的百分比不同,也就是組分的相對含量不同,如表5所示。以洗脫峰7為例,河北的丹參相對百分含量為5.28%,山東的為20.17%,江蘇的為9.07%。含量因產地、氣候、采摘期等原因有了較大的區別,由此可見建立中藥指紋圖譜控制中藥質量、監測中藥有效成分是十分必要的。

  中藥指紋圖譜的建立通常依賴高效液相色譜法和薄層層析法,本文提出將HSCCC作為建立指紋圖譜的方法之一。在2.2中已得出結論:3個產地丹參的HSCCC洗脫圖譜,不但洗脫峰個數一致,而且對應洗脫峰為同一組分,這是利用HSCCC建立指紋圖譜的基礎。因不存在非共有峰,且12個洗脫組分分別對應,初步將這12個洗脫組分定義為共有指紋峰。由表6可見,HSCCC法建立的指紋圖譜各共有指紋峰保留時間的相對標準偏差(Relativestandarddeviation,RSD)最大為2.88%,平均為2.48%,符合國家標準關于方法學考察資料技術參數對RSD≤3%的要求。因此,HSCCC作為制訂指紋圖譜的方法之一具有可行性。

  在制訂指紋圖譜的實踐中,適宜使用內容積50mL的分析型HSCCC,并控制運行溫度,可以大大縮短運行時間,并提高精密度。本研究因實驗條件所限選用半制備型HSCCC,它可以在制訂出指紋圖譜的同時,制備足量樣品供結構鑒定及活性鑒定用。

  3.結論

  不同產地、氣候、收獲期對中藥材有效成分的含量甚至種類有一定的影響,所以需要建立指紋圖譜來控制中藥材質量。以丹參為模式物,利用國產高速逆流色譜有效地進行了分離純化,得到12個洗脫組分。比較各洗脫組分在反相層析中的保留時間和吸收光譜峰值,認為3條HSCCC洗脫曲線中各組分依次對應。這就具備了將HSCCC用于制訂指紋圖譜的重要基礎。3條洗脫曲線中不存在非共有峰,初步將這12個洗脫組分定義為共有指紋峰,各指紋峰相對保留時間的相對標準偏差RSD均<3%,符合國家建立指紋圖譜方法學考察資料的技術參數。如果采用分析型HSCCC,并對溫度進行控制,HSCCC的精密度有望得到明顯提高。

  將HSCCC用于制訂中藥材指紋圖譜的實際操作中還須依照國家標準,建立檢測方法的方法學考察資料,包括:供試品的穩定性實驗(同一供試品在不同時間檢測),儀器的精密度(同一供試品連續進樣5次以上),實驗方法的重現性(同一批號的供試品5份以上)等等。HSCCC對高粘度樣品和易造成填料吸附的化合物的分離有較大優勢,其儀器及常用試劑十分廉價易于推廣,作為建立指紋圖譜的方法具有可行性。


醫學百科App—醫學基礎知識學習工具


頁:
返回頂部】【打印本文】【放入收藏夾】【收藏到新浪】【發布評論



察看關于《高速逆流色譜法分離純化丹參并嘗試制訂中藥指紋譜》的討論


關閉

網站地圖 | RSS訂閱 | 圖文 | 版權說明 | 友情鏈接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 醫源世界 版權所有
醫源世界所刊載之內容一般僅用于教育目的。您從醫源世界獲取的信息不得直接用于診斷、治療疾病或應對您的健康問題。如果您懷疑自己有健康問題,請直接咨詢您的保健醫生。醫源世界、作者、編輯都將不負任何責任和義務。
本站內容來源于網絡,轉載僅為傳播信息促進醫藥行業發展,如果我們的行為侵犯了您的權益,請及時與我們聯系我們將在收到通知后妥善處理該部分內容
聯系Email:
上海快3开奖走势图-百度